低溫肉制品是指在常壓下通過蒸、煮、熏、烤等熱加工過程使肉制品的中心溫度控制在68～72 ℃，并且需要在0～4 ℃的低溫環境下貯藏、運輸及銷售的一類肉制品。與高溫肉制品（通常采用121 ℃、0.1 MPa的高溫高壓加熱方式）相比，低溫肉制品能夠最大限度地保留肉類原有的營養成分及風味物質，是世界肉類產品的發展趨勢。低溫肉制品在蒸煮階段一般采用68～72 ℃的殺菌工藝，冷卻后在無菌車間進行切分，真空包裝為此類肉制品的主要包裝形式，保質期一般為2～4 周，保質期的長短主要取決于初始菌量及貯藏溫度。

本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進行菌株的培養、分離與純化以及PCR擴增，通過擴增核糖體DNA限制性分析（amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA），并對菌株的生理生化特性進行研究，為進一步采取有效的防腐保鮮措施、延長產品的貨架期提供參考。

1、菌株的菌落特征及PCR鑒定結果

本研究分別采用涂布法和傾注法對菌株進行培養，根據樣品稀釋液在BHI培養基上所生長細菌菌落的表型差異，共篩選出12 株腐敗菌，編號為n01～n12，12 株菌的基本形態特征如表1所示。菌株的分離和篩選主要依據其形態、顏色等特征，不排除篩選出同一種屬、甚至同一菌株的可能性。

所有菌株經過PCR擴增（16S rDNA）后均出現了清晰可辯的特異性條帶，條帶大小為1 500 bp左右。其中菌株n01、n04、n05、n09、n10的PCR擴增結果如圖1所示。

2、ARDRA結果

ARDRA是限制性片段長度多態性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）在核糖體DNA序列上的應用。最初的RFLP技術的依據是不同生物個體之間DNA片段的酶切位點有所差異，經限制性內切酶消化后能夠產生長短、種類、數目不同的限制性片段，基于對限制性片段的分析，從DNA水平比較不同個體之間的差異。ARDRA則是根據16S rDNA基因序列的限制性片段區分菌株種的差異。

12 株菌的16S rDNA分別經EcoRⅠ和SpeⅠ雙酶切、TaqⅠ單酶切后，均可獲得便于區分的酶切圖譜。根據條帶的相似性可以將12 株菌分為5 組，第1組包括n01、n02、n03和n08，第2組包括n05、n06和n07，第3組包括n09和n11，第4組包括n10和n12，第5組僅包括n04。同一組內菌株的酶切圖譜具有較高的相似性，表明這些菌株之間存在一定的親緣關系。

3、菌株系統進化樹的構建

n01和n08與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、n02與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、n03與特基拉桿菌（Bacillus tequilensis）親緣關系最近，它們均屬于芽孢桿菌屬（Bacillussp.）；n04與嗜冷桿菌屬（Psychrobactersp.）親緣關系最近；n05、n06和n07與魏斯氏菌屬（Weissellasp.）親緣關系最近；n09和n11與鏈球菌屬（Streptococcussp.）親緣關系最近；n10和n12與腸球菌屬（Enterococcussp.）親緣關系最近。

4、菌株的生理生化鑒定結果

參照GenBank比對結果，根據《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《常見細菌系統鑒定手冊》對菌株進行相應的生理生化鑒定。由表2可知，n01和n08為枯草芽孢桿菌，n02為解淀粉芽孢桿菌，n03為特基拉芽孢桿菌，n04為嗜冷桿菌屬的Psychrobacter urativorans（暫無中文命名），n05、n06和n07為魏斯氏菌屬中的綠色魏斯氏菌，n09和n11為巴黎鏈球菌，n10和n12為糞腸球菌。

結論

本研究對真空包裝低溫熟牛肉中的腐敗菌進行分離，并結合表型分析、ARDRA、系統進化樹的構建對菌株進行鑒定。結果表明，分離得到的12 株菌中，4 株為芽孢桿菌屬，3 株為綠色魏斯氏菌，2 株為巴黎鏈球菌，2 株為糞腸球菌，1 株為嗜冷桿菌。其中，綠色魏斯氏菌是導致樣品變綠的主要原因，總體來說，乳酸菌是真空包裝低溫熟肉制品中的主要腐敗菌。本研究為進一步采取有效的防腐保鮮措施、延長低溫肉制品的貨架期提供了理論依據。